Sam Hopkins est né au Texas en 1912 et s'initie très jeune à la musique : à huit ans il confectionne sa première guitare avec une boîte de cigare et du grillage à poule pour les cordes et à dix ans, il commence à jouer avec son cousin, le chanteur de country blues Alger "Texas" Alexander et avec Blind Lemon Jefferson qui le pousse à continuer.
Au milieu des années 1930, un séjour à la prison de Houston, l'obligera à mettre de côté la musique. À sa sortie, il retrouve Alexander et se remet à jouer avec lui dans les clubs de blues.
C'est en 1946 qu'il sera découvert par Lola Anne Cullum du label Aladdin Records de Los Angeles qui l'enregistre pour la première fois. Il est associé pour l'occasion avec un pianiste du nom de Wilson "Thunder" Smith et c'est à la suite de cette association que Sam Hopkins reçoit son surnom Lightnin' (en anglais thunder signifie « tonnerre » et lightning « éclair »).
Katie May, la chanson "phare" qui sort de cette première séance d'enregistrement devient très vite un grand succès.
Le talent d'Hopkins impressionne le label : il enregistrera 43 autres fois pour Aladdin Records, mais ses enregistrements ne sortent pas de la communauté noire.
Il lui faudra attendre 1959 et sa rencontre avec le producteur Sam Chambers pour que sa musique devienne populaire auprès du public blanc.
Il se tourne alors vers une guitare acoustique et devient une célébrité lors du renouveau du folk blues des années 1960. Il fait alors l'ouverture de grands groupes de rock psychédélique comme le Grateful Dead et Jefferson Airplane.
Au début des années 1970, son succès l'amène à faire une tournée en Europe où il joue pour la reine Élisabeth II. Mais sa santé fragile va le contraindre à s'éloigner des studios d'enregistrement.
Lightnin' Hopkins meurt en 1982 d'un cancer de l'œsophage à Houston.
Ses funérailles réuniront plus de 4 000 personnes dont de nombreux fans et musiciens.
Lightnin' Hopkins a enregistré plus de 85 disques, .
Parmi ses plus grands succès, on peut citer : Katie May, Baby please don't go (chanson que Big Joe Williams écrivit en 1935, ensuite reprise par Lightnin' Hopkins et de nombreux chanteurs de blues ainsi que par plusieurs groupes de rock tels les Them, Aerosmith ou ACDC), Shotgun Blues, Abilene et Short Haired Woman ainsi que son chef-d'œuvre Mojo Hand.
Bien qu'il soit un joueur de blues plutôt solitaire, son album avec Sonny Terry "Last Night Blues" fut un grand succès.